آزمایشگاه بیوشیمی1
مقـدمه و تئوری :
کربوهیدرات به پلی هیدروکسی آلدئید یا پلی هیدروکسی کتون و یا ترکیباتی که به این دو گروه هیدرولیز میشوند اطلاق میگردد. دسته ای از کربوهیدراتها را که نمیتوانند به ترکیب ساده تری شکسته شوند. مونوساکارید میگویند. گروهی را که در اثر هیدرولیز به دو مولکول مونوساکارید تجزیه شوند دی ساکارید و بالاخره کربوهیدراتهایی که به چندین واحد مونو ساکارید تجزیه میشوند را اولیگوساکارید گویند و چنانچه تعداد واحدهای تشکیل دهندة آن بیش از شش عدد باشد پلی ساکارید نامیده میشود.
مونوساکاریدها را میتوان به دو گروه عمده تقسیم کرد: اگر مونوساکاریدها دارای عامل آلدئیدی باشند آنها را آلدوز و چنانچه عامل کتونی داشته باشند آنها را کتوز مینامند.
از لحاظ احیا کنندگی نیز قندها را به دو دسته احیا کننده و غیر احیا کننده تقسیم میکنند. قندهای احیا کننده به علت داشتن گروههای احیا کننده آلدئیدی یا کتونی دارای خاصیت فوق هستند. قندهای احیا کننده میتوانند یونهای فلزاتی مثل مس دو ظرفیتی (Cu2+) و یون نقره را در محیط قلیایی احیا کنند. مس دو ظرفیتی پس از احیا به صورت مس یک ظرفیتی (Cu+) در می آید. این یون کمتر از مس دو ظرفیتی در آب محلول است و در نتیجه به صورت رسوب سبز رنگ CuOH یا رسوب قرمز رنگ Cu2O و یا مخلوط زرد رنگی از این دو ترکیب در می آید. اگر PH محیط اسیدی شود (مانند آزمایش بارفورد) و همچنین زمان حرارت دادن کنترل شود، فقط مونو ساکاریدها به این آزمایش جواب مثبت میدهند.
الف) آزمایش مولیش (تمامی قندها جواب مثبت میدهند): اسید سولفوریک غلیظ باعث هیدرولیز اتصالات گلیکوزیدی شده، ایجاد مونوساکارید میکند. مونوساکارید تولید شده آب خود را از دست میدهد و به فورفورال و مشتقات آن تبدیل میشود. سپس این ترکیب با آلفا نفتل کمپلکس بنفش رنگی ایجاد میکند.
ب) آزمایش بندیکت : تمام قندهاي احيا کننده اعم از مونوساکاريدها و دي ساکاريدها به اين آزمايش جواب ميدهند. محلول بنديکت يون مس دو ظرفيتي به صورت کمپلکس سيترات ميباشد. در اين محلول قليائي Cu2+ در محيط باقي ميماند و بصورت Cu(OH)2 رسوب نميکند. املاح مس دو ظرفيتي (محلول آبي رنگ) در حضور يک قند احيا کننده، احيا شده و تبديل به مس يک ظرفيتي (رسوب قرمز آجري رنگ) ميشوند
ج) آزمایش بارفود: این آزمایش برای تشخیص مونو ساکاریدها از دی ساکاریدهای احیا کننده است. چنانچه آزمایش احیا قندها در محیط اسید ضعیف صورت گیرد و مدت زمان حرارت دادن کنترل شود، فقط مونو ساکاریدها به علت قدرت احیا کنندگی قوی به این آزمایش جواب مثبت میدهند.
وسایل و مواد مورد نیاز : لوله آزمایش – قطره چکان – محلول قندی –معرف α فنول – معرف بندیکت – معرف بارفود – اسید سولفوریک
روش آزمایش :
الف ) آزمایش مولیش :
2 میلی لیتر از محلولی که در آن قند وجود دارد برمی داریم.
2 قطره معرف α نفتول به آن اضافه می کنیم.اینها را مخلوط می نماییم.
3 میلی لیتر اسید سولفوریک،خیلی آرام از جداره لوله آزمایش به محلول اضافه می کنیم.
اگر قند موجود باشد رنگ محلول بنفش می شود.
ب ) آزمایش بندیکت :
1 میلی لیتر از محلول قندی بر می داریم.
2 میلی لیتر معرف بندیکت به ان اضافه می نماییم.
محلول را مخلوط می کنیم.
5 دقیقه در حمام آب گرم قرار می دهیم.
رسوبی به رنگ سبز یا نارنجی ایجاد می شود.
ج ) آزمایش بارفود :
1 میلی لیتر از محلول قندی بر می داریم.
2 میلی لیتر محلول بارفود به آن اضافه می کنیم.
5 دقیقه در حمام آب گرم به آن حرارت می دهیم.
رسوبی به رنگ سبز یا نارنجی ایجاد می شود که نشان وجود دی ساکارید است.
شنــاسایی لیــ ـپیدها
لیپیدها بیوملکولهایی هستند که در تمامی سلول ها یافت می شوند و دارای حلالیت بسیار کمی در آب هستند ولی در حلال های آلی مانند اتر، کلروفورم، بنزن و... به خوبی حل می شوند. این ترکیبات علاوه بر اینکه ذخیره انرژی بشمار می روند درساختمان غشاهای سلولی نیز به کار رفته و تجمع آنها در زیر پوست، لایه محافظتی ای را در مقابل حرارت و ضربه بوجود می آورد.
لیپید ها را می توان به صورت زیر به دسته های مختلف تقسیم بندی کرد:
اسید های چرب- چربی های خنثی ( گلیسریدها یا آسیل گلیسرول ها ) - موم ها - فسفو لیپید ها –اسفنگولیپیدها- استروییدها- گلایکولیپیدها - لیپوپروتیین ها- گلیسیریل اترها- ترپن ها
اسیدهای چرب:
این دسته از لیپیدها ساختمان اسید مونوکربوکسیلیک دارند و دارای تعداد اتم کربن معمولا زوج در یک زنجیره خطی هستند. اسید های چرب می توانند به صورت اشباع و غیر اشباع باشند.
چربی های خنثی:
این دسته از لیپیدها تری آسیل گلیسرول دارند و تری گلیسیرید هم نامیده میشوند.طول زنجیره هیدروکربنی اسیدهای چرب می تواند متفاوت بوده و دارای پیوند دو گانه نیز باشند.
موم ها:
موم ها به صورت پوششی محافظت کننده بر روی میوه جات و برگ گیاهان و نیز روی مو و پوست جانوران ایفای نقش می کنند. موم ها، استر های اسید چرب اشباع و یا غیر اشباع بلند زنجیر با الکل های نوع اول بلند زنجیر می باشند.
فسفو لیپیدها:
ساختمان شیمیایی این ترکیبات عبارت است از یک مولکول گلیسرول که 2 اسید چرب در موقعیت 1 و 2 آن استریفیه شده و به موقعیت 3 آن نیز یک گروه فسفات متصل شده و یک الکل قطبی مثل کولین یا اتانول آمین نیز به گروه فسفات متصل شده است.
اسفنگو لیپیدها
اسفنگو لیپیدها دومین دسته بزرگ لیپیدهای غشایی را تشکیل می دهند و مانند فسفو لیپیذها دارای یک سر قطبی و دو دنباله غیر قطبی هستند ولی بر خلاف فسفو لیپید ها دارای گلیسرول نیستند.
استروییدها:
این گروه از چربی ها از مشتقات پرهیدروسیکلوپنتانوفنانترن محسوب می شوند. همه استروییدها دارای ساختمان چهار حلقه ای هستند. و از معروف ترین آنها می توان کلسترول، اسیدهای صفراوی و هورمون های جنسی را نام برد.
روش کار :
خصوصیات چربی ها :
1 – حلالیت : 5 میلی لیتر روغن مایع بر می داریم.
به همان اندازه در لوله های جداگانه آب ، الکل ،کلروفرم و استن می ریزیم.
روغن در آب حل نمی شود.
روغن در الکل حل نمی شود.به محلول 10 دقیقه حرارت می دهیم باز هم حل نمی شود.
روغن در کلروفرم حل می شود.
روغن در استن حل می شود.
2 – اکسیداسیون چربی ها : 5/. میلی لیتر روغن مایع بر می داریم.
به همان اندازه کربنات سدیم و پرمنگنات پتاسیم به آن اضافه می کنیم.
پرمنگنات سدیم رنگ خود را از دست می دهد.
شناسایی کلسترول :
آزمایش سالکوفسکی : 1 میلی لیتر محلول کلروفرمی چربی بر می داریم.
1 میلی لیتر اسید سولفوریک به آن اضافه می کنیم.
رنگ محلول تغییر می کند ( نشانه وجود کلسترول)
آزمایش لیبرمن – بورشارد :
1 میلی لیتر محلول کلروفرمی چربی را برمی داریم.
1 میلی لیتر انیدریک اسید و 2تا 3 قطره اسید سولفوریک به آن اضافه می کنیم.
رنگ محلول تغییر می کند (نشانه وجود کلسترول)
ادامه آزمـایش قنـدها
آزمایش سلیوانف:جهت تشخیص آلدوز یا کتوز بودن مونوساکاریدها بکار می رود. در این آزمایش کتوهگزوزها در مجاورت اسید کلریدریک آب از دست داده، به هیدروکسی متیل فورفورال تبدیل میشوند. این ترکیبات با رزورسینول ترکیب شده به کمپلکس قرمزرنگی تبدیل میگردند. آلدوزها در شرایط سخت تری با رزورسینول واکنش میدهند.
آزمایش بارفود: این آزمایش برای تشخیص مونو ساکاریدها از دی ساکاریدهای احیا کننده است. چنانچه آزمایش احیا قندها در محیط اسید ضعیف صورت گیرد و مدت زمان حرارت دادن کنترل شود، فقط مونو ساکاریدها به علت قدرت احیا کنندگی قوی به این آزمایش جواب مثبت میدهند.
آزمایش ید: ید با پلی ساکاریدها ایجاد کمپلکس رنگی میکند. برای ایجاد کمپلکس رنگی وجود حد اقل 8 مولکول گلوکز در یک زنجیر خطی لازم است. رنگ ایجاد شده به طول زنجیره مولکولها بستگی دارد. مثلا آمیلوز، رنگ آبی تیره، آمیلوپکتین، رنگ ارغوانی و گلیکوژن، رنگ قهوه ای مایل به قرمز تولید میکند.
اين واكنش مخصوص پلي ساكاريدهايي نظير نشاسته و گليكوژن است.
وسایل و مواد مورد نیاز آزمایش:
لوله آزمایش – قطره چکان - معرف سلیوانف – محلول های قندی - اسید کلریدریک
روش آزمایش:
آزمایش ساکاروز: 3 میلی لیتر محلول ساکاروز را بر می داریم.
به میزان 3-4 قطره اسید کلریدریک 1 درصد به آن اضافه می کنیم.
5 دقیقه در حمام بن ماری حرارت می دهیم.
بعد از این محلول بی رنگ 1 میلی لیتر بر می داریم و آزمایش سلیوانف را انجام می دهیم.
آزمایش سلیوانف : 1 میلی لیتر از محلول قندی داریم.
2 میلی لیتر معرف سلیوانف به آن اضافه می کنیم.
5 الی 10 دقیقه به آن در حمام بن ماری حرارت می دهیم.
بعد از این مدت رسوب قرمز پررنگ داریم.
آزمایش بارفود : 1 میلی لیتر از محلول قندی بر می داریم.
2 میلی لیتر محلول بارفود به آن اضافه می کنیم.
5 دقیقه در حمام آب گرم به آن حرارت می دهیم.
رسوبی به رنگ سبز یا نارنجی ایجاد می شود که نشان وجود دی ساکارید است.
آزمایش ید (لوگل) : 2 میلی لیتر محلول قندی را بر می داریم.
چند قطره معرف لوگل به آن اضافه می کنیم.
رنگ محلول بنفش می شود که دلیل وجود نشاسته است.
این مطلب در تاریخ: شنبه 14 ارديبهشت 1392 ساعت: 11:7 منتشر شده است